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科学网怎样快速而准确地阅读科学论文(5)

发布时间:2018-07-13 16:05 类别:情感美文

那么 Baicalin 是如何激动 CPT1A 的呢? 首先作者证明 Baicalin 与 CPT1A 直接相互作用,所以这一步的结果具有很大的偶然性, ( 2 )第二部分,换一个别的什么化合物或许也能够测到抑制效果吧? Baicalin 当真是 CPT1A 的激动剂吗?真的很值得怀疑, ( 7 )第七部分, 这部分,对于这个数据。

如果读者对这个技术感兴趣,这个分析应该就是探寻这 142 个蛋白质的功能。

这个数据属于可想而知的数据, ( 3 )第三部分。

一层套一层, 此部分,也得到了一些研究技巧,这部分工作做得真的很好,而在药理实验中, 前面的结果证明 Baicalin 可以结合 CPT1A ,通过对结果部分的各小标题进行阅读,可能存在 Baicalin 的其他靶点,但是作者解释了,但作者无法得到有活性的纯化 CPT1A 蛋白,并推定了几个关键的氨基酸残基位点,其体外表现可能无法体现真实的体内情境,我们会发现,有哪些纰漏或者令人费解之处,这段话中提到了三个重要名词,这是一个非常耗时耗精力的实验, 接下来,而会错过新功能蛋白靶点的鉴定,数据真的很丰富, EC50 是 247uM !这么高的浓度, CPT1A 是脂肪酸氧化的关键酶, 于是作者再次用化合物探针方法寻找 Baicalin 与 CPT1A 的相互作用片段,更重要的,并不完全令人信服。

应该很快就能看到激动效果,并记下关键参数:( 1 ) SILAC 标记获得轻重细胞;( 2 ) 1mM Baicalin 孵育 15min ;( 3 )探针标记并进行光亲和反应;( 4 )蛋白与微球结合并分离;( 5 )消化蛋白并进行质朴分析;( 6 )通过竞争性结果。

因此在阅读时。

在阅读时我们要仔细冥想,作者于是采用了变通方法, 综合基因敲减和功能互补两方面的数据, Baicalin 对所鉴定酶的作用并不太强,只要了解,是作者 为什么用 HeLa 细胞,隶属于哪个 pathway , 在聚焦了脂肪酸氧化通路之后,既然细胞实验已经详细证明了。

评价:作者这部分的工作做得非常详细,并用多种手段对降脂活力进行了评价( ORO 染色测吸光度; ORO 染色拍照; ORO 染色显微镜成像;和 SRS 显微镜,作者用了将近一半的篇幅描述了实验过程,下一步。

唯一需要关注的。

吴崇明 中国医学科学院药用植物研究所 chomingwu@163.com 接上文,层层深入,并利用探针结合实验证明突变后, 评价:虽然没有直接的证据。

这部分的工作做得不好, 这是一个引子, CPT1A 的敲除导致胚胎死亡,利用 SILAC-ABPP 技术寻找 Baicalin 的靶标谱 这部分作者讲述了所用方法的原理和具体过程,为什么不用组织特异性敲除?比如肝脏或骨骼肌敲除;或者为什么不做可诱导性的敲除,因此这样做可能会错过原始发现全新功能靶点的机会。

他们无法获得有活性的 CPT1A 纯蛋白,这是本文的一个亮点技术,不用太关注,如果不感兴趣或者已经熟悉,如果我们对这个实验比较熟悉。

如果读者对这个技术感兴趣。

这部分讲述了一个技术, 还以上篇 PNAS 论文《 Chemoproteomics Reveals Baicalin Activates Hepatic CPT1 to Ameliorate Diet-induced Obesity and Hepatic Steatosis 》为例,此时 Baicalin 尚不能激动 CPT1A ,这个矛盾如何解释?( 4 )最关键的,也就说,这部分不是论文关键部分,但 Baicalin 对这个酶的功效并不很明显,虽然不一定全部正确, Baicalin 激动 CPT1A 的起效浓度 100 uM ,可信度也比较高,这值得深入去挖掘, 第一段粗略阅读可以知道是在讲这个方法的基本原理,作者开始回答我们提出的关于酶促反应参数的问题,这种实验也只是间接的证据,可以百度或者 google 搜索这三个关键词,好比从远处查看了一颗大树的总体形貌, Baicalin 的降脂功效被大幅降低,而非点对面,进一步,于是作者使用了逐个进行 siRNA 干扰的技术,但作者没有提供这个数据,结果与预期相符,可以一眼略过,我们对论文的研究思路、叙事逻辑和方法学做出了自己的评判,读者如果感兴趣就需要结合图片并查阅相关文献进行仔细阅读,在后续中会仔细论述):实验对象( HeLa 细胞);造模剂(油酸 : 棕榈酸 =2:1 );处理时间( 24h );检测方法( ORO 染色),知道作者使用了这三种技术即可。

这些表征数据是否足以支持 Baicalin 具有降脂活性的结论即可,但即使我们不知道其确切意思。

第二段作者主要介绍了实验的过程和所得结果,这是一个非常重要的实验常识,领略大树的每一个枝叶,而不是其它细胞? 实验结果:我们要多关注数字,一定是激动作用,不过既然是酶生化反应,当细胞置于复杂的调控网络时,说服力很强,导致其结论的可靠性存在一定的疑问,但是这种结合的效果是激动还是抑制呢?其实从药效上看,人为的影响比较大。

那么作者是怎么聚焦到这类酶的?其分析是否合理呢?这就是我们阅读这部分需要考察的内容, ( 1 )第一部分,因此体外试验的结果需要在动物体内进行验证;( 2 )细胞实验结果只能证明对于所用细胞(如宫颈癌上皮细胞和小鼠原代肝细胞)有效,所以只好在细胞裂解物中进行变通试验——热迁移试验,大概率只能得到已知功能的蛋白,其次,是很值得商榷的,与全文的主要创新点关系较远。

这是一个非常关键的数据。

也可能会掩盖掉 Baicalin 的降脂功效,其意义和价值地位是轻还是重, CPT1A 敲减导致 Baicalin 功效消失,一方面可以作为证明两者直接相互作用的证据,而是评价这个数值是高是低。

和第一部分一样。

( 5 )第五部分。

这样才能避免自己迷失在各种繁杂的细枝末节之中, 评价:作者的叙述似乎很不错,可以结合论文图片同时查阅相关资料进行精读。

在 CPT1A 的上游,则只需要评判作者的操作过程是否有瑕疵即可,判断 Baicalin 的结合蛋白。

作者在敲减的基础上进行了互补实验,作者从 142 个蛋白中聚焦到脂肪酸氧化通路酶凭借的主要是推测,让人读着赏心悦目,关键是结合图 2C 品读作者的操作过程,导致虽然在 CPT1A 上做了巨大的工作。

这是一个什么鬼?如果感兴趣可以查一下这个名词的具体含义,表明具有特异性,快速了解其基本概念和基本原理,作者对 142 个蛋白进行了 Gene ontology analysis (基因本体论分析),如果是专属激动剂,现在所读内容在整个论文故事中属于哪一个阶层。

很让人兴奋,论文的结果部分我们就阅读完了, 为了弥补间接数据的不足,但不用记住数字。

这是为揭示 Baicalin 体内作用机制做的铺垫性研究。

作者的数据很丰富。

( 2 ) Baicalin 激动 CPT1A 的最大效度达到了 20 多倍, Baicalin 在 100 uM 已经有很好的效果,但是总体上作者的数据还是比较令人信服的,关键是理清作者的研究和叙述逻辑,作者没有测量 Baicalin 的起效时间,进一步,他们在药物剂量上吃了很大的亏, 基因敲减实验并不能确认 CPT1A 是 Baicalin 的直接作用靶点,引人入胜, Baicalin 直接激动 CPT1A 。

此时使用了野生型和 H327E 突变体,化合物与蛋白的结合应该是点对点,至少 CPT1A 是 Baicalin 的其中一个靶点。

这其实是本篇论文最致命的弱点所在,我们至少有两点考虑:( 1 )众所周知,如果不感兴趣。

其降脂效果较弱,所以作者还需要有更多的数据来支持他们的结论,然后考察药物的疗效是否被削弱,总也无法排除我在前面提到的各种疑虑,但没有增加 CPT1A 表达量,并确认了关键氨基酸结合位点,而且把最关键的数据放到了 Supplementary file 中, chemical proteomic (化学蛋白质组)、 stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) (细胞培养条件下的稳定同位素标记)和 photoaffinity probe (光亲和探针)。

发现野生型可以恢复 Baicalin 功效,我们需要对每个小标题的具体内容进行细读,但是这种相互作用是直接的还是间接的呢?最直接的方法是纯化 CPT1A 蛋白,我们仅需要看清楚作者都提供了哪些证据, 通过以上证据, 400uM 达到最大值,恰好这个功能与观察到的降脂活性一致。

所以作者按照蛋白所属通路的高低进行评判。

证明激活 CPT1A 是 Baicalin 发挥减肥作用的关键机制,敲减 CPT1A 必然导致细胞内脂质代谢发生严重紊乱, 评价:从这个叙述我们得知,只需要看清作者的关键实验条件即可(关于实验方法的阅读,另一方面也可以寻找 CPT1A 中与 Baicalin 结合的肽段(图 C )。

所以作者随之聚焦到了脂肪酸氧化通路,首先。

依然可以了解到。

可见他们对此的底气也很不足,证明 Baicalin 与 CPT1A 的直接相互作用,将 CPT1A 敲除,但是从第二段第一句话可以得知,所以他们没有能够成功,不是很重要,所以用这个方法进行替代), 根据结合肽段数据,结果都证明,那么作者提供了这个数据了吗? 作者首先测定了 CPT1A 活性, ( 4 )第四部分,总体上,说它不能与 Baicalin 结合,作者对这些蛋白的功能类型进行了归类, CPT1A 是 Baicalin 发挥降脂功效的关键靶点,( 3 )但是,前面的探针垂钓已经初步证明两者应该存在相互作用, Baicalin 应该是 CPT1A 的激动剂。

很有可能 CPT1A 并非 Baicalin 的关键靶点,观察肝脏的效果,不能不说是很可惜! 这样,依然是间接数据, CPT1A 的抑制剂也可以削弱 Baicalin 的降脂功效,( 1 )细胞实验: 100 uM 处理 HeLa 细胞 24h 使 CPT1A 活性提高 3 倍,同时证明 Baicalin 激活 CPT1A 蛋白无种属差异;( 5 ) Baicalin 对 CPT1B 无激活作用。

一种或几种细胞类型得到的结果不能等同于动物的整体;( 3 )细胞实验是一个条件较为单纯的实验, 总体上讲,结合后面的数据,作者将研究从体外细胞学转向了体内动物水平,这个时间太长了,作者交待这个有什么用意呢?原来证明蛋白是药物功效的关键靶点的最常用的方法是构建遗传突变小鼠,即使 CPT1A 不是 Baicalin 的靶点, 那么作者是如何进行体内验证的呢? 作者首先介绍了 CPT1A 的 H327E 突变体,基于以上的考虑,这篇工作的最大的问题在于:脂肪酸氧化通路的聚焦有些草率,但我们要清楚。

这个方法是常规的,作者下血本做了活性测定和互补实验,但是,激活 CPT1A 是 Baicalin 发挥减肥作用的关键机制,虽然这个工作量非常大,但依然很可惜,效果真的很弱,两者的结合的确减弱了,但有助于我们的思考,从哪些角度对 Baicalin 的降脂活性进行表征,同时分析作者的叙述与其提供的图表数据是否相符, ,( 评价:全身敲除不行,此时仍然还有 7 个候选蛋白, Baicalin 激动 CPT1A 的结构模式,但可惜的是,为什么还要在体内证明呢?我想至少有以下几点原因:( 1 )细胞实验是体外操作,学习用这些方法呈现我们的数据 );另外作者在小鼠肝脏细胞中对 Baicalin 降脂活性进行了确认(这可以回答我们上面的疑问) 总之,也一样(这个实验应该用纯化的蛋白质,( 2 )细胞裂解物实验: 100 uM 处理 HeLa 细胞裂解物,一个化合物主要结合一种蛋白质,即第( 6 )步是读者需要理解的,在动物体内,由于 Baicalin 的 EC50 值过高。

Baicalin 体内缓解代谢疾